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本试剂盒为动物细胞死活检测提供了双色荧光染色方法。本试剂盒采用两种广泛常用的荧光探针，通过检测细胞内酯酶活性和质膜完整性两个方面反映细胞活力。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光多孔板、扫描仪、流式细胞仪以及其他荧光检测系统。本试剂盒可以应用于大多数的真核哺乳动物细胞，包括贴壁细胞核某些组织，但不适用与细菌、酵母。该方法更快捷安全且灵敏度更高。

在钙黄素AM存在活细胞内时，其特点就是由于胞内无所不在的酯酶活性作用，由几乎无荧光、具有细胞膜透性的钙黄素AM生成具有强烈荧光信号的绿色荧光物质(Ex/Em：495nm/520nm)。而对于受损的细胞膜来说，碘化丙啶(PI)可以传过进入细胞，与核酸结合，荧光信号从而放大40倍，产生一个明亮的红色荧光信号的死细胞(Ex/Em：530nm/620nm)。

组分	规格
组份A：Calcein AM(4mM in无水DMSO)	100μL
组份B：PI(16mM in DMSO)	100μL

保存：-20℃，避光，有效期6个月。


一、荧光显微镜操作

1. 制备工作液(2μM calcein AM,8μM PI)
   钙黄素AM和PI的浓度选择依据所用的细胞类型不同而有区别，应当根据具体细胞调节染料浓度以得到最佳效果。一般来说，满足信号足够的前提下，尽可能选择最低浓度的染料剂量。钙黄素AM和PI推荐浓度范围为0.1～10μM。
   
   1. 取出钙黄素AM和PI试剂原液，室温平衡30分钟。
      
   2. 加入5μL 16mM的PI储液至10mL的PBS中，涡旋震荡混匀，得到8μM的PI溶液。
      
   3. 将5μL 4mM的钙黄素AM储液加入到10mL的PI溶液中，涡旋混匀，确保充分混匀。
      
   4. 所得到的的工作液(2μM钙黄素AM和8μM PI)可直接用于染色细胞。
      注意：钙黄素AM的水溶液容易发生水解，应当当天用完。
2. 准备细胞并开展实验
   
   5. 贴壁细胞可以用培养瓶或者小室爬片。非贴壁细胞同样可以。
      
   6. 正式开始实验前，洗涤细胞，确保除去培养基中含有的活性酯酶。用PBS温和洗涤贴壁细胞，去除上清。非贴壁细胞用离心管收集离心，PBS洗涤去除上清。
      
   7. 加入足量的上述工作液，保证没过单层细胞。
      
   8. 室温孵育30～45分钟。
      
   9. 对于贴壁细胞，吸出染色工作液终止孵育。加入10μL的PBS至干净的载玻片，覆以盖玻片，以指甲油密封，防止水份蒸发。
      
   10. 荧光显微镜下观察标记细胞。
       光学滤光片选择：
       钙黄素和PI可以在传统的荧光长通道滤光器中被观察到，两者可以被分开观察到。各种滤光器的列表如下：
       长波和双发射滤波器有助于钙黄绿素和PI同时观看
       Omega Filters:XF25,XF26,XF115
       Chroma Filters:11001,41012,71010
       单独观察钙黄素的滤波器
       Omega Filters:XF22,XF23
       Chroma Filters:31001,41001
       单独观察PI的滤波器
       Omega Filters:XF32,XF43,XF102,XF108
       Chroma Filters:31002,31004,41002,41004

二、荧光微孔板操作

1. 制备工作液(2μM calcein AM,8μM PI)
   
   1. 取出钙黄素AM和PI试剂原液，室温平衡30分钟。
      
   2. 加入5μL 16mM的PI储液至10mL的PBS中，涡旋震荡混匀，得到8μM的PI溶液。
      
   3. 将5μL 4mM的钙黄素AM储液加入到10mL的PI溶液中，涡旋混匀，确保充分混匀。
      
   4. 所得到的的工作液(2μM钙黄素AM和8μM PI)
      
   5. 如需单独计算活、死细胞比例请单独配制1mL 2μM的钙黄素AM溶液和1mL 8μM的PI溶液。
2. 准备细胞并开展实验
   每孔细胞的最低监测值大约为200～500个，每孔最大常用细胞检测值约为106。
   
   6. 培养贴壁或者悬浮细胞。按照您的实验要求处理细胞。准备活细胞与死细胞的对照样品。死细胞可以用0.1%皂角苷或者0.1～0.5%的毛地黄皂苷处理10分钟得到。
      
   7. PBS洗涤细胞。对于贴壁细胞，加入100μL PBS覆盖孔底，对于悬浮细胞，可以直接在离心管中操作，再以PBS重悬。将含有细胞的缓冲液，每孔100μL加入至微孔板各孔。细胞样品的洗涤注意要确保除去培养基中的活性酯酶，否则会引起背景。
3. 使用荧光酶标仪测量荧光
   为了获得最佳的灵敏度，所使用的酶标仪，建议采用带光学过滤器的信号激发器，可保证不互相干扰。钙黄素可以用(485±10nm)的荧光光学滤光器激发，而PI可以用(530±12.5nm)的典型罗丹明光学滤光器来兼容。而发射光信号可以通过滤光器得到很好的分开采集，钙黄素530±12.5nm，PI是645±20nm。
   
   8. 如有需要，准备对照实验样本的死活细胞百分比。如是测量死活细胞的相对增量，那么对照可以不用设置。对照样品可以有：无细胞对照(G、H)，活细胞对照(E、F)和死细胞对照(C、D)。
      
   9. 每孔加入100μL的钙黄素AM和PI工作液，终体积为200μL，每孔含1μM钙黄素和4μM PI的终浓度。室温孵育30～45分钟。
      
   10. 用合适的激发和发射滤光片收集样本数据。
       A：645nm，实验组细胞样本，同时标有钙黄素AM和PI=F(645)sam
       B：530nm，实验组细胞样本，同时标有钙黄素AM和PI=F(530)sam
       C：645nm，死细胞样本，只标有PI=F(645)max
       D：645nm，死细胞样本，只标有钙黄素AM=F(645)min
       E：530nm，活细胞样本，只标有PI=F(530)min
       F：530nm，活细胞样本，只标有钙黄素AM=F(530)max
       G：530nm，无细胞样本或者不加染料=F(530)0
       H：645nm，无细胞样本或者不加染料=F(645)0
       
       1. 光学滤光片选择
          活细胞和死细胞的相对数量可以表示为在530nm下(在更长波长下荧光信号有限)的百分比或细胞绝对数，死细胞的特点是在600nm下有强荧光信号，而530nm处有弱荧光信号。在计算结果之前，可以将背景的荧光读数F(530)₀和F(645)₀分别从F值530和645中减去。
          
       2. 活细胞的百分比可以定义为荧光读数的计算：
          %Live Cells=(B-E)/(C-D)
          
       3. 死细胞的百分比可定义为荧光读数的计算：
          %Dead Cells=(A-D)/(C-D)
          
       4. 计算绝对活死细胞数量
          设置细胞数与荧光读数(530nm)和(645nm)的标准曲线，荧光强度与样本中的细胞数成线性正相关。

三、流式细胞仪
本试剂盒可以方便地应用于流式细胞仪。悬浮细胞或经胰酶消化的贴壁细胞，可以类同荧光显微镜染色操作步骤(参见荧光显微镜操作)。对于流式的检测分析，通过PBS离心洗涤细胞再以PBS重悬，反复操作2次之后，以钙黄素AM和PI的工作液孵育悬浮细胞30～45分钟，即可上机检测。
相关搜索：活死细胞染色试剂盒(Calcein AM/PI法)，细胞活力检测试剂盒，活死细胞染色试剂盒